¿Qué es la espectroscopia de fluorescencia?
La espectroscopia de fluorescencia analiza la fluorescencia de las moléculas en función de sus propiedades fluorescentes.
La fluorescencia es la luminiscencia que ocurre cuando una molécula es excitada por un fotón a un estado excitado electrónicamente para volver al estado fundamental.
La espectroscopia de fluorescencia utiliza un haz de luz para excitar los electrones en ciertas moléculas compuestas y hacer que emitan luz. La luz pasa a través de un monocromador y entra en un detector donde se detecta, que se utiliza para medir e identificar moléculas o cambios en las moléculas.
Introducción a la espectroscopia de estado-estable de fluorescencia y las pruebas de por vida
La fluorescencia se refiere ampliamente al fenómeno de la luminiscencia, la luz emitida por las moléculas. Hay varios tipos de brillo.
La fotoluminiscencia es la emisión de fotones excitados por energía luminosa o fotones.
La quimioluminiscencia, definida como la luminiscencia de fotones excitados por energía química, incluye la bioluminiscencia, como se ve en las luciérnagas y en muchas formas de vida marina.
La electroluminiscencia es la emisión de fotones cuando la energía eléctrica o un fuerte campo eléctrico estimula los fotones, como en algunas aplicaciones de iluminación.
Específicamente, la fluorescencia es un tipo de fotoluminiscencia donde la luz pone a los electrones en un estado excitado. El estado excitado pierde rápidamente energía térmica hacia el medio ambiente a través de la vibración y luego emite fotones desde el estado excitado de singlete más bajo. Este proceso de emisión de fotones compite con otros procesos no radiativos, incluida la transferencia de energía y la pérdida de calor.
Cuando se usa el término "fluorescencia", generalmente se aplica el mismo método de medición a cualquiera de las clases de luminiscencia anteriores.
¿Qué es la espectroscopia de fluorescencia?
Espectros de excitación y emisión de fluorescencia reflejados entre sí. La espectroscopia de fluorescencia utiliza la emisión y la excitación para ver cómo cambia una muestra.
Fig. 1: Un espectro de excitación de fluorescencia (azul) y un espectro de emisión (púrpura) son imágenes especulares entre sí
La espectroscopia de fluorescencia de estado-estacionario es cuando una molécula emite fluorescencia cuando es excitada por una fuente de luz constante, y los fotones emitidos o la intensidad se detectan en función de la longitud de onda. El espectro de emisión de fluorescencia es cuando se fija la longitud de onda de excitación, se escanea la longitud de onda de emisión y se obtiene la relación entre la intensidad y la longitud de onda de emisión.
El espectro de excitación de fluorescencia es cuando se fija la longitud de onda de emisión, cambiando la longitud de onda del monocromador de excitación, escaneando la intensidad en diferentes longitudes de onda. De esta forma, el espectro proporciona información sobre la muestra y las longitudes de onda de absorción para seleccionar la longitud de onda de emisión única óptima para la detección de emisión. Es similar a la espectroscopia de absorción, pero es una técnica más sensible en términos de límites de detección y especificidad molecular. Los espectros de excitación son específicos de una única especie/longitud de onda de emisión, en relación con los espectros de absorción de todas las especies absorbentes en la solución o muestra de medición. Los espectros de emisión y excitación de un fluoróforo dado son imágenes especulares entre sí. Por lo general, los espectros de emisión aparecen en longitudes de onda más altas (energías más bajas) que los espectros de excitación o absorción.
Estos dos tipos espectrales (emisión y excitación) se utilizan para observar cómo cambia la muestra. La intensidad espectral y la longitud de onda máxima pueden variar con variables como la temperatura, la concentración o las interacciones con las moléculas circundantes. Esto incluye el enfriamiento de moléculas y moléculas o materiales involucrados en la transferencia de energía. Algunos fluoróforos son sensibles a las propiedades del entorno del solvente, como el pH, la polaridad y ciertas concentraciones iónicas.
¿Qué tipos de moléculas o materiales exhiben fluorescencia?
Espectros de emisión de fluorescencia de algunos fluoróforos comunes. Los fluoróforos desempeñan un papel central en la espectroscopia de fluorescencia y hacen de este tipo de espectroscopia una técnica muy sensible.
Fig. 2: Espectros de emisión de fluorescencia de algunos fluoróforos comunes en el espectro UV y visible
Las moléculas y materiales fluorescentes vienen en todas las formas y tamaños. Algunos son inherentemente fluorescentes, como la clorofila y los residuos de aminoácidos triptófano (Trp), fenilalanina (Phe) y tirosina (Tyr). Otras son moléculas sintetizadas como colorantes orgánicos estables o etiquetas que se pueden agregar a otros sistemas no-fluorescentes. Generalmente, las moléculas orgánicas fluorescentes tienen características estructurales como anillos aromáticos y electrones conjugados π-. Dependiendo de su tamaño y estructura, los tintes orgánicos emiten luz en longitudes de onda que van desde el ultravioleta hasta el infrarrojo cercano-.
A continuación se muestran algunos fluoróforos comunes aleatorios cuya emisión se puede ver abarcando el rango UV-Vis. Para algunos elementos de tierras raras, como los lantánidos, debido a que se llenan los orbitales electrónicos más altos, se producen transiciones electrónicas debido a la transferencia de carga de los ligandos metálicos entre los orbitales 4f-5d o incluso 4f-4f. (Bunzli, 1989) Hay muchas moléculas que emiten luz en la naturaleza, como algunos aminoácidos, clorofila y pigmentos naturales. Otros están cuidadosamente diseñados para usos especiales en espectroscopia de fluorescencia.
Ejemplos de moléculas y materiales fluorescentes:
Aminoácidos (Trp, Phe, Tyr)
Derivados de pares de bases (2-AP, 3-MI, 6-MI, 6-MAP, pirrol-c, tC)
clorofila
Proteínas fluorescentes (FP)
Colorantes orgánicos (fluoresceína, rodamina, n-aminocumarinas y sus derivados)
Elementos de tierras raras (lantánidos)
semiconductor
puntos cuánticos
nanotubos de carbono de -pared simple
Bateria solar
Pigmento, Galvanoplastia
fósforo
Más…
Otras moléculas y materiales como proteínas fluorescentes, semiconductores, fósforos y elementos de tierras raras son muestras fluorescentes de uso común. Los polímeros que contienen hidrocarburos aromáticos conjugados o dienos a menudo también tienen propiedades fluorescentes. Por supuesto, los científicos también han estado trabajando en la creación de nuevos materiales.
